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常见问题


     
 最近很多朋友问我代谢组学是什么,该怎么做实验设计,数据怎么分析的问题,我将我碰到的一些问题回复如下:
1、代谢组学是什么?
       代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科,是系统生物学的重要组成部分。基因组学和蛋白质组学分别从和蛋白质层面探寻生命的活动,而实际上细胞内许多生命活动是与代谢物相关的,如细胞信号(cell signaling),能量传递等都是受代谢物调控的。代谢组学正是研究代谢组(metabolome)——在某一时刻细胞内所有代谢物的集合——的一门学科。基因与蛋白质的表达紧密相连,而代谢物则更多地反映了细胞所处的环境,这又与细胞的营养状态,药物和环境污染物的作用,以及其它外界因素的影响密切相关。因此有人认为,基因组学和蛋白质组学能够说明可能发生的事件,而代谢组学则反映确实已经发生了的事情。
但是从茫茫多的代谢产物中选取研究对象,无疑是大海捞针。代谢组学研究通过一定的手段能够帮助研究员从代谢产物海中跳出来,提供一个“航拍”的视角,一目了然地发现差异性代谢产物。然后通过已知的代谢通路逆推找出调节酶和基因,完成疾病发病机制、药物治疗机制等方面的研究。

2、为什么选择代谢组学作为科研技术手段?
1)小分子的产生和代谢是生物机体作用的最终结果,生物体液的代谢产物分析能够更直接,更准确的反映生物体的病理生理状态。
2)基因和蛋白质表达的有效微小变化会在代谢物上得到放大,从而使检测更容易;
3)代谢组学的代谢物信息库简单,但它远没有全基因组测序及大量表达序列标签的数据库那么复杂;
4)代谢物的种类少,要远小于基因和蛋白质的数据,物质的分子结构要简单得多。
5)代谢产物在各个生物体系中都是类似的,所以代谢组学研究中采用的技术更容易在各个领域中通用,也更容易被人接受。

3、代谢组学检测的手段有哪些?
       主要技术手段是核磁共振(NMR ),液-质联用(LC-MS),气-质联用(GC-MS),色谱(HPLC,GC)等。通过检测一系列样品的谱图,再结合化学模式识别方法,可以判断出生物体的病理生理状态,基因的功能,药物的毒性和药效等,并有可能找出与之相关的生物标志物(biomarker)。

4、代谢组学可以检测哪些样品?
       代谢组学主要研究的是作为各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物(MW<1000)。其样品主要是尿液,血浆或血清,唾液,以及细胞和组织的提取液。我们也做过植物,真菌,微生物提取物,脑脊液,淋巴液,昆虫血淋巴,羊水,卵泡液,膝盖滑液,眼泪,精液,粪便及肠道内容物提取液等。

5、我的实验该如何设计?
       很多朋友都做过基因芯片,高通量测序,蛋白组学的实验,检测人员都会告诉您,3-4次生物学重复足够了,如果经费紧张,1对1的实验也做过不少,还有把同组样品pooling的,但是代谢组学却不是这样。

我给大家提供一个参考值:
       植物,微生物设计6-8个平行样品,模式动物设计10个左右平行样品,临床标本设计20-30例平行样品(所有样品当然越多越好)。
       注意,样品不能pooling,不能反复冻融,血清/血浆不能溶血。另外,如果是用血浆,请用肝素钠抗凝,EDTA抗凝效果不好。
       如果是做NMR,还需要注意不能有酒精(取样的时候注意),麻醉剂的选择。如果是尿液,粪便,肠道内容物等,还需要添加叠氮化钠。

6、样品需要准备多少量?
1.微生物和细胞样本:迅速钝化代谢活动(淬灭),同时保持细胞不裂解;
2.动物体液(如尿、血、组织、器官、唾液):采样后要迅速预处理,如加入抗凝血剂、防腐剂,并立即冷冻处理(-80 ℃ );
3.植物样本:采集后迅速冷冻(液氮),然后转入-80 ℃ 保存,200mg/例。
4.血清样品:200ul/例,一定避免反复冻融。(血液收集在离心管中静置30分钟进行凝固。然后离心取上清装载干净的离心管中,再离心5分钟,4000rpm,取上清分装到冻存管中,每管0.2ml,-80度冻存寄送。)
5.尿液样品:1ml/例,原则上可以多取一点。(尿液直接分装到离心管中,每管1ml,添加一滴(约10ul)质量体积为1/100(w/v)的叠氮化钠,-80度冻存寄送。)

7、数据该怎么分析?
数据分析的内容包括:
Part01:数据预处理
Part02:PCA分析
Part03:PLS-DA分析
Part04:OPLS-DA分析
Part05:差异化合物筛选
Part06:差异化合物鉴定
Part07:多组分关联分析(同一个体同时取多组分)
Part08:代谢通路分析
Part09:多组学数据关联分析(具备多组学数据)
 
8、代谢组学后续怎么做?分子机制怎么研究?
最近很多战友发邮件过来问,代谢组学做完了下一步做什么?怎么阐述分子机制?
        其实如果光靠代谢组学一门科学是很难讲清楚生物作用机制的,而且所谓“组学”技术本身只是一个打基础的工作,给科研指明方向。
代谢组学做完以后主要分如下几方面来进行进一步研究:
1)定性定量验证工作 目前比较好的验证手段是采用三重四级杆进行靶标验证,获得绝对定量信息。另外也可以采用一些验证的试剂盒。
2)分子功能验证 我们通过前期untarget实验,找到一些显著调控的通路以后(方向),我们需要去验证一下分子的功能。
3)进行其他组学的补充 比如蛋白质组学,转录组学,我们都清楚多组学之间是有关联的。
4)其他 暂时没有想到,欢迎大家补充。

9、质谱的类型
1)四级杆质谱仪,QMS;(是最常见的质谱仪器,定量能力突出,在GC-MS中QMS占绝大多数,无串极能力,定性能力不足,分辨力较低(单位分辨),存在同位素和其他m/z近似的离子干扰。比如安捷伦的7890A/5975C系统)
2)飞行时间质谱仪,TOFMS;(速度最快的质谱仪,分辨能力好,有助于定性和m/z近似离子的区别。无串极功能,限制了进一步的定性能力。售价高于QMS,较精密,需要认真维护。比如leco pegasus HT GC-TOF-MS系统)
3)三重四级杆质谱仪,QQQ(定量能力非常好,分辨力不足);
4)离子阱质谱仪,ITMS;
5)线性离子阱,LinearIonTrap;
6)四级离子阱,QTrap;
7)四级杆飞行时间串联质谱,QTOF;(作为质量过滤器,以TOFMS作为质量分析器,能够提供高分辨谱图定性能力好于QQQ,速度快,适合于生命科学的大分子量复杂样品分析。成本高,需要仔细维护。比如Waters ACQUITY UPLC/Micromass Q-TOF Premier MS 系统)
8)离子阱-飞行时间质谱,TrapTOF;
9)线性离子阱-飞行时间质谱,LIT-TOF;
10)磁质谱,SectorMS;
11)傅立叶变换质谱仪,FT-ICR-MS;
12)静电场傅立叶变换质谱,Orbitrap。